Adsorptie
Het beroemde "H5N1" staat voor "hemagglutinine type vijf, neuraminidase type één" - deze twee eiwitten steken uit op het oppervlak van het influenzavirus (in figuur 1 is hemagglutinine groen en neuraminidase grijs).
Met behulp van hemagglutinine hecht het influenzavirus zich aan receptoren op het celoppervlak. Het initiële doelwit van het virus zijn de cellen van het trilharenepitheel van de luchtwegen, maar dit is niet waarom we er zo dol op zijn: hemagglutinine kan zich hechten aan de receptoren van veel andere cellen, waaronder rode bloedcellen. Als één virus zich tegelijkertijd aan twee (aangrenzende) rode bloedcellen hecht, blijven de rode bloedcellen aan elkaar plakken! Vandaar de naam van het eiwit - "bloedlijmen".
rijst. 1
Implementatie
De domme cel absorbeert het virus dat zich eraan heeft gehecht door middel van fagocytose, en eet het op. Waarom stoppen kinderen altijd allerlei nare dingen in hun mond?! Het virus bevindt zich echter nog steeds in de cel als voedsel, in een fagocytotisch blaasje (in figuur 2 - “endosoom”). Het endosoom versmelt met het lysosoom, er wordt een spijsverteringsvacuole gevormd, protonen worden er vanuit het cytoplasma in gepompt om een zure omgeving te creëren (dit proces wordt getoond in figuur 2) - nog een beetje, en we zullen het virus verteren (met de woorden "eiwitvoedsel, wat is het verschil").
rijst. 2
Strip
Maar het virus is klaar voor deze gang van zaken:
 rijst. 3 |
- Hemagglutinine wordt gemodificeerd onder invloed van een zure omgeving - het oppervlak wordt hydrofiel en het (nu voorheen gehecht aan de receptor op het binnenoppervlak van het endosoommembraan) is ingebed in dit membraan.
- Protonen die in het endosoom worden gepompt, passeren speciale kanaaleiwitten (M2-eiwitten, aangegeven in Fig. 1 en Fig. 3) door de lipidenomhulling van het virus en bereiken de eiwitomhulling van het virus (in Fig. 1 - een cirkel van witte ballen - M1-eiwitten). Hierdoor wordt de eiwitomhulling vernietigd (in figuur 3 worden de M1-eiwitten van de vernietigde eiwitomhulling aangegeven als rode sterren).
- De lipidenenvelop van het virus versmelt (door de penetrerende werking van hemagglutinine) met het (lipide)membraan van het fagosoom; Het RNA van het virus komt terecht in het cytoplasma van de cel.
Replicatie van virussen
Het virus-RNA dat in het cytoplasma vrijkomt, is zelf volkomen veilig.
- Er kunnen geen eiwitten op worden gemaakt, omdat het minus RNA is (eiwitten worden er niet door gecodeerd, maar door de complementaire plusstreng, die nog niet bestaat).
- Het is ook onmogelijk om er RNA op te maken; onze cellen beschikken over het algemeen niet over een enzym dat in staat is om RNA te verdubbelen.
“Oh-ho-ho, je hebt niets”, bromt het griepvirus terwijl hij zijn besnorde hoofd schudt, “maar het is oké, ik heb alles meegenomen.” Het virus bracht de eiwitten PB1, PB2 en PA met zich mee, die samen het virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase vormen - het kan RNA dupliceren. Maar pech! Elke polymerase heeft een primer nodig om te kunnen werken, maar de vergeetachtige griep heeft dat niet meegenomen! Alles is voorbij?!
Rustig, geen paniek! - Met deze woorden wordt het hele bedrijf (8 virale RNA's en 3 virale enzymen) naar de celkern gestuurd. Daar krijgt de griep volledige service:
- primers voor virale RNA-replicatie (om plus-RNA te verkrijgen) zijn secties die zijn gekliefd van cellulair RNA;
- verwerking: secties die dienden als primers voor RNA-synthese - dit waren doppen, dus de modificatie van het 5"-uiteinde werd helemaal aan het begin uitgevoerd; aan het einde van de synthese vindt polyadelatie van het 3"-uiteinde plaats;
- splicing: een deel van het virale RNA dat informatie bevat voor twee eiwitten, wordt in twee delen geknipt.
Op deze manier worden plus-RNA's gesynthetiseerd, die kunnen dienen als sjablonen voor de synthese van virale eiwitten en virale minus-RNA's.
Dan is alles eenvoudig: de domme cel synthetiseert, met behulp van zijn eigen ribosomen uit zijn eigen aminozuren, de eiwitten van het virus, inclusief RNA-afhankelijke RNA-polymerase. Influenza minus RNA wordt ook krachtig geproduceerd in de kern. De assemblage van virale deeltjes vindt plaats in het cytoplasma, op het binnenoppervlak van het celmembraan. Het voltooide virus verlaat de cel door exocytose (ontluikende), neuraminidase bijt in de laatste draad die de cel en het pasgeboren virus verbindt... Een nieuw (kwaad) klein leven komt de wereld in!
rijst. 4
BIJ GRIEP IRISES: GEBEURTENISSEN EN VOORSPELLINGEN
DK Lvov, AD Zaberezjny, T.I. Aliper
Dmitry Konstantinovich Lvov, academicus van de Russische Academie voor Medische Wetenschappen, directeur van het vernoemde Onderzoeksinstituut voor Virologie. DI. Ivanovsky RAMS, hoofd van de afdeling Virologie, Medische Academie van Moskou. HEN. Sechenov. Projectmanager 05-04-52136, 06-04-48822.
Alexey Dmitrievich Zaberezhny, doctor in de biologische wetenschappen, hoofd van het laboratorium voor moleculaire diagnostiek van hetzelfde instituut, hoofd van de afdeling moleculaire biologie van de NPO Narvak.
Taras Ivanovich Aliper, doctor in de biologische wetenschappen, hoofd van het laboratorium voor middelen voor specifieke preventie van virusziekten van hetzelfde instituut, directeur van de NPO Narvak.
Voor de eerste publicatie van het artikel, zie: Nature. 2006. Nr. 6. blz. 3–13.
Griepepidemieën komen elk jaar voor en worden niet als iets bijzonders ervaren. Omdat de ziekte wordt veroorzaakt door virussen die al bekend zijn bij het immuunsysteem,
In de regel gaat hij ermee om. Een pandemie is een andere zaak: in dit geval is de veroorzaker van de griep een virus met nieuwe antigene en biologische eigenschappen, dat zich snel over de hele wereld verspreidt, tot een kwart van de wereldbevolking treft en tientallen miljoenen levens eist. Dit is wat de pandemieën van de vorige eeuw beroemd heeft gemaakt. Het was onmogelijk om ze te voorzien, net zoals het onmogelijk is om het exacte tijdstip van het begin van de nieuwe te noemen.
Dankzij de constante monitoring van virussen die circuleren onder mensen, huisdieren en wilde dieren, en dankzij de kennis die is verkregen met behulp van moleculair genetische methoden, is het nu echter al mogelijk om de opkomst van nieuwe virusvarianten met pandemische neigingen te voorspellen. De afgelopen jaren is een kandidaat voor deze rol geïdentificeerd: het aanvankelijk niet-pathogene vogelvirus H5N1 veroorzaakte eind 2003 een griepepidemie onder pluimvee, die dit jaar uitgroeide tot een panzoötie. Dit virus begint andere dieren, waaronder mensen, te infecteren, maar kan nog niet van persoon op persoon worden overgedragen. Om dit vermogen te verwerven, is het voldoende om slechts één aminozuur in een van de virale eiwitten te vervangen.
Virion-structuren
De structuur van het influenzavirus is vrij eenvoudig: het is een bolvormig deeltje (virion) met een diameter van ongeveer 0,13 micron, in de kern, dat een nucleocapside (een RNA-molecuul verpakt in een omhulsel van M1-eiwit) bevat, omgeven door een lipidemembraan (Fig. 1). In dit membraan zijn drie eiwitten ondergedompeld: hemagglutinine, neuraminidase en een ionkanaal (M2-eiwit), die een belangrijke rol spelen in het infectieuze proces.
Hemagglutinine is het eerste dat in contact komt met gastheercelreceptoren. Op het oppervlak van de virale envelop wordt het gepresenteerd in de vorm van zeer complexe trimeren. Elk van hun monomeren is stevig verankerd in het membraan en bevat twee subeenheden: één ervan zorgt voor primair contact met de doelcel, de andere is verantwoordelijk voor de fusie van de virale en cellulaire membranen. Bovenaan het eiwit bevinden zich gebieden die binden aan siaalzuur, dat deel uitmaakt van de gastheercelreceptor.
Het enzym neuraminidase splitst de terminale siaalzuurgroepen van cellulaire receptoren af, waardoor de cel het vermogen verliest om het antigeen te herkennen en het virus binnendringt
B OLOGIE EN MEDISCHE WETENSCHAP | Influenzavirussen: gebeurtenissen en voorspellingen |
komt het binnen via endocytose, een gebruikelijke methode om stoffen in de cel af te geven. De zure omgeving van het endosoom dat uit het celmembraan komt, activeert het M2-ionkanaal, waardoor de pH in het virale deeltje wordt verlaagd, wat leidt tot de vernietiging van de M1-eiwitomhulling. Tegelijkertijd wordt hemagglutinine geactiveerd. Het wordt gesynthetiseerd in de vorm van een voorloper, die in een zure omgeving overgaat in een volwassen toestand - het wordt door proteolytische enzymen in twee subeenheden gesplitst, terwijl het fusiepeptide verborgen in het trimeer van conformatie verandert, vrijkomt en naar het bovenste uiteinde beweegt van het molecuul en wordt in het membraan gebracht. De virale envelop versmelt met de endosomale, er wordt een fusieporie gevormd, waardoor een pad zich opent naar het cytoplasma voor vreemd genetisch materiaal. Het virale RNA komt vervolgens de celkern binnen. Als gevolg hiervan worden de vitale processen van de cel verstoord en begint de cel zelf, met behulp van zijn eigen hulpbronnen, virale eiwitten te produceren. Onmiddellijk repliceert viraal RNA en worden nieuwe virusdeeltjes samengesteld, die met behulp van neuraminidase vrijkomen uit beschadigde cellen (hun afbraakproducten veroorzaken intoxicatie van het lichaam en koorts) en verspreiden zich via de bloedbaan door het lichaam.
Fig. 1. Diagram van het influenzavirusvirion. De lipoproteïne-omhulling is bedekt met stekels van twee glycoproteïnen: hemagglutinine en neuraminidase. Binnenin bevindt zich een nucleocapside - een RNA-molecuul verpakt in een omhulsel van M1-eiwit. Het genoom bestaat uit acht fragmenten, waarvan de eerste zes elk voor één eiwit coderen (hemagglutinine - HA, neuraminidase - NA, RNA-polymerase-subeenheden - PB1, PB2, PA, nucleoproteïne
NP), en de laatste twee genen - twee eiwitten met elk unieke aminosequenties
nozuren (matrixeiwitten - M1, M2 en niet-structurele eiwitten - HS1, HS2).
Het vermenigvuldigde virus remt de hematopoëtische en immuunsystemen, beschadigt het endotheel van de haarvaten, wat leidt tot verhoogde vasculaire permeabiliteit en bloedingen, waaronder hersenoedeem met fatale afloop. Maar dit gebeurt vrij zelden, meestal wordt het immuunsysteem ingeschakeld - eerst zijn de factoren van aangeboren (niet-specifieke) immuniteit erbij betrokken, en na een tijdje beginnen er specifieke antilichamen te worden geproduceerd, die ze vrijgeven en, bij herinfectie, het lichaam beschermen. van het virus.
Een onderscheidend kenmerk van influenzavirussen is de hoge variabiliteit van antigene eigenschappen. Interne eiwitten zijn constant in hun structuur en bepalen het type virus (A, B en C). Oppervlakte-antigenen zijn daarentegen heterogeen en variabel, en meer
B OLOGIE EN MEDISCHE WETENSCHAP | Influenzavirussen: gebeurtenissen en voorspellingen |
Dit geldt ook voor hemagglutinine (H), dat samen met neuraminidase (N) het subtype van het virus bepaalt (H1N1, H2N2, H3N2, enz.). Antigene variabiliteit van oppervlakte-eiwitten wordt veroorzaakt door twee genetische processen: drift- en shift-veranderingen in het virale genoom.
Driftveranderingen worden veroorzaakt door puntmutaties in de genen die coderen voor hemagglutinine en neuraminidase en leiden tot kleine veranderingen in de structuur van deze eiwitten. Dergelijke veranderingen treden doorgaans tussen pandemieën op voor alle soorten virussen (A, B en C). Als gevolg hiervan komen er elk jaar eerder epidemieën dan pandemieën voor, aangezien de bescherming tegen eerdere contacten met het virus blijft bestaan, ook al is deze onvoldoende.
Shift-veranderingen treden op na een volledige genvervanging. Dit is mogelijk omdat het genoom van het influenzavirus gesegmenteerd is - het bestaat uit acht fragmenten van enkelstrengs lineair RNA, dat, naast hemagglutinine en neuraminidase, codeert voor een virusspecifiek enzym (RNA-polymerase of transcriptase, bestaande uit drie subeenheden - eiwitten PB1, PB2, PA), evenals een nucleoproteïne (NP), matrix- (M1 en M2) en niet-structurele (NS1 en NS2) eiwitten. Wanneer een cel tegelijkertijd door twee verschillende stammen wordt geïnfecteerd, worden de segmenten van hun replicerende genomen in elke combinatie gemengd, zodat de nieuwe virionen verschillende sets genen bevatten die van elk van de oorspronkelijke virussen zijn geleend. Deze combinatie van virale RNA-segmenten wordt genetische shuffling of herschikking genoemd, om niet te worden verward met de reeds bestaande term - recombinatie, waarbij het genetische materiaal wordt herschikt, hetzij door het kruisingsmechanisme, hetzij als gevolg van een verandering in de sjabloon. Veranderingen in de verschuiving beïnvloeden in de regel de antigene structuur van hemagglutinine, minder vaak - neuraminidase. Zo verschijnen er met onregelmatige tussenpozen (10-40 jaar) virussen met nieuwe antigene en biologische eigenschappen, waaronder nieuwe pandemische varianten.
Soortenbarrière
Onder de virussen die epidemische noodsituaties kunnen veroorzaken, waarvan de bestrijding in het stadium van hun optreden moeilijk of zelfs onmogelijk is, zijn influenza A-virussen bijzonder gevaarlijk. Ze worden gekenmerkt door een hoge antigene heterogeniteit van oppervlakte-eiwitten en zijn volgens de nomenclatuur, door 16 hemagglutininesubtypen (H1-16) en 9 neuraminidase (N1-9). Deze virussen zijn wijdverspreid van aard en kunnen alle soorten vogels en sommige soorten zoogdieren (mensen, paarden, varkens, walvissen, zeehonden, enz.) infecteren. Infectie van zoogdieren vindt voornamelijk plaats via de luchtwegen, en bij vogels - via de darmen. Hun infectie is meestal asymptomatisch of in de vorm van enteritis, wat duidt op een hoge mate van wederzijdse aanpassing van influenzavirussen en wilde vogels, die als hun natuurlijke gastheren kunnen worden beschouwd. Het virus blijft in water aanwezig, bij +22°C – tot een maand, bij +4°C en lager – gedurende een langere tijd (6-8 maanden). constante circulatie van het influenzavirus in de natuur.
Ondanks antigene heterogeniteit werden virussen met alle bekende combinaties van oppervlakte-eiwitten alleen geïsoleerd uit wilde vogels van de aquatische en semi-aquatische complexen - eenden, meeuwen, enz. (Fig. 2).
Alleen virussen met een bepaald aantal oppervlakte-eiwitten circuleren onder andere dieren: tot voor kort werden bijvoorbeeld virussen van slechts drie hemagglutinine-subtypen (H1-H3) en twee neuraminidase-subtypen (N1-N2) uit mensen geïsoleerd. Alle vier de pandemieën van de twintigste eeuw. werden veroorzaakt door nieuwe varianten van deze subtypes: de “Spaanse griep” in 1918 werd veroorzaakt door het influenza A-virus van het H1N1-subtype, de “Aziatische griep” in 1957 – H2N2, de “Hong Kong-griep” in 1968 – H3N2 en de “Russische griep” in 1977 - H1N1. Het zijn allemaal reassortanten van vogel- en menselijke griepvirussen.
B OLOGIE EN MEDISCHE WETENSCHAP | Influenzavirussen: gebeurtenissen en voorspellingen |
Tot voor kort werd aangenomen dat vogelgriepvirussen niet pathogeen zijn voor mensen en, indien geïnfecteerd, alleen conjunctivitis en milde malaise kunnen veroorzaken, en in zeldzame gevallen een mild ademhalingssyndroom. In 1997 veroorzaakten H5N1-virussen echter extreem ernstige vormen van ziekte onder mensen in Hong Kong: van de 18 mensen die ziek werden, stierven er zes, allemaal opgelopen door kippen. Een tweede soortgelijke episode vond plaats in februari 2003, eveneens in Hong Kong: van de vijf besmette mensen stierven er twee. H5N1-virussen zijn periodiek geïsoleerd uit kippen en andere vogelsoorten (inclusief wilde vogels) in lokale populaties.
Fig. 2. Schema van de circulatie van bekende subtypes van influenza A-virussen.
Het H9N2-serotypevirus, wijdverspreid onder pluimvee in China en andere Aziatische landen, werd in augustus 1998 bij vijf Chinezen ontdekt, en een jaar later in Hong Kong bij twee meisjes met een klinisch beeld van een griepachtige ziekte. Het is opmerkelijk dat alle ziektegevallen onafhankelijk van elkaar plaatsvonden en dat er geen overdracht van virussen van persoon op persoon werd waargenomen. In 1996 werd het vogelgriepvirus H7N7 geïsoleerd bij een vrouw die aan conjunctivitis leed. Eén geval in Nederland resulteerde in de dood. Dit zijn alleen die gevallen die officieel zijn geregistreerd; in werkelijkheid overwinnen vogelgriepvirussen blijkbaar veel vaker de soortbarrière en beginnen niet alleen mensen te infecteren, maar ook andere dieren (varkens, paarden, walvissen, nertsen, enz.) . Er zijn gevallen bekend van infectie van pluimvee (kippen, kalkoenen) met influenzavirussen die kenmerkend zijn voor wilde vogels, vooral watervogels.
Het is nog steeds moeilijk om met vertrouwen alle factoren te beoordelen die het gastheerbereik van het virus beperken, en de mechanismen die de verandering van gastheer beïnvloeden. Deze zoektocht is al geruime tijd gaande, bij verschillende onderzoeksgroepen, ook bij ons instituut.
Hemagglutinine was de eerste die onder verdenking kwam, omdat het dit glycoproteïne is dat verantwoordelijk is voor het herkennen van gastheercelreceptoren en betrokken is bij de fusie van de virale envelop met de endosomale envelop (in wezen een deel van de cytoplasmatische envelop van de gastheercel). De structuur van deze receptoren verschilt afhankelijk van de soort en weefseloorsprong van de cellen. Deze verschillen zijn belangrijk voor het beperken van de overgang van virussen tussen soorten en zijn specifiek onderzocht in relatie tot de opkomst van nieuwe menselijke pandemische virussen.
Er is vastgesteld dat de receptoren van epitheelcellen van de menselijke luchtwegen, naast eiwitten, koolhydraten bevatten - sialo-oligosachariden, waarin het terminale siaalzuur (N-acetylneuraminezuur) is verbonden met galactose door een 2′-6 'binding, en de celreceptoren
B OLOGIE EN MEDISCHE WETENSCHAP | Influenzavirussen: gebeurtenissen en voorspellingen |
darmepitheel van vogels - 2′-3′. Vogelgriepvirussen reproduceren zich slecht in het menselijk lichaam omdat ze eenvoudigweg geen contact kunnen maken met menselijke receptoren. Tegelijkertijd bevatten mucines (van nature dezelfde complexe glycoproteïnen met aan het einde siaalzuur), die verplicht zijn de menselijke longen tegen micro-organismen te beschermen, receptoren met een 2′-3′-galactosebinding. Een vogelgriepvirus dat per ongeluk het menselijk lichaam binnendringt, kan dus niet de cellen binnendringen, omdat er geen specifieke receptoren op hun oppervlak zijn en de herkenningsactiviteit van virionreceptoren wordt geblokkeerd door mucine, zodat een persoon in dit geval slechts een lichte loopneus heeft. .
Maar hoe kunnen we in dit geval de opkomst van pandemische varianten van het virus verklaren? De situatie werd iets duidelijker toen bekend werd dat cellen van de luchtwegen van varkens beide soorten receptoren dragen en dienovereenkomstig kunnen worden geïnfecteerd door griepvirussen van zowel mensen als vogels. Dit betekent dat varkens potentieel kunnen dienen als tussengastheer voor verschillende virussen en een ideale arena voor hun herschikking tijdens gemengde infecties.
Wat hemagglutinine betreft, lijkt het vermogen ervan om cellulaire receptoren van de gastheer te herkennen voornamelijk verband te houden met de structuur van de receptorbindingsplaats (RBS). Bij menselijke influenzavirussen bevat de PCC dus de aminozuren leucine en serine op respectievelijk posities 226 en 228, en bij vogelvirussen worden glutamine en glycine op deze posities aangetroffen. Andere aminozuursubstituties zijn bij verschillende dieren in de PCC gevonden, wat betekent dat, hoewel de PCC geconserveerd en evolutionair stabiel is, deze nog steeds variabele gebieden heeft die de receptorbinding (affiniteit) en specificiteit beïnvloeden.
De PCC kan veranderen nadat het virus de interspeciesbarrière heeft overwonnen; virussen kunnen bijvoorbeeld het vermogen verwerven om menselijke celreceptoren te herkennen. Een bewijs dat de barrière tussen vogels en mensen kan worden overwonnen, is de uitbraak van menselijke griep in Hong Kong in 1997, veroorzaakt door het vogel-H5N1-virus.
Er wordt aangenomen dat de "hechting" van het virus aan de gastheer niet alleen wordt bepaald door de kenmerken van hemagglutinine, maar ook door een ander oppervlakte-eiwit: neuraminidase. Bovendien is er reden om aan te nemen dat de genen van interne en niet-structurele eiwitten van influenza A-virussen betrokken zijn bij het beperken van het bereik van gastheren. Het is echter nog te vroeg om hierover te praten, omdat het nog steeds nodig is om de bijdrage ervan te bestuderen elk gen en de functies van hun producten. Het is echter belangrijk om te begrijpen dat zelfs minimale veranderingen in de structuur van virale eiwitten, vooral hemagglutinine, kunnen leiden tot significante veranderingen, niet alleen in het gastheerbereik van het virus, maar ook in de mate van pathogeniteit (virulentie).
Virulentie
Laten we niet vergeten dat voor de reproductie van het virus in het lichaam van de gastheer de activering van de voorloper van het hemagglutininemolecuul noodzakelijk is, en dat dit door de proteasen van de gastheer in twee subeenheden wordt gesplitst. Proteolyse van hemagglutinines van laagpathogene vogelvirussen vindt plaats in een beperkt aantal celtypen, dus het virus is alleen gelokaliseerd in de luchtwegen of het darmkanaal. Dit gebeurt bij asymptomatische of matige infecties. De hemagglutinines van hoogpathogene vogelvirussen worden in verschillende cellen afgebroken en kunnen daarom dodelijke systemische infecties veroorzaken, vooral bij pluimvee.
Verschillende laboratoria over de hele wereld begonnen het genoom van hoogpathogene influenzavirusstammen voor mensen te bestuderen (H5N1 en H7N7, geïsoleerd in 1997-2004). Het bleek dat deze virussen verschillende basische aminozuren bevatten op de splitsingsplaats van het hemagglutininemolecuul, waardoor ze een hoge infectieuze activiteit en pathogeniciteit hebben. In tegenstelling tot niet-pathogene of zwak pathogene virussen, die deze aminozuursequentie niet hebben, wordt het hemagglutinine van hoogpathogene virussen gemakkelijk gesplitst, niet alleen door trypsine-achtige proteasen die aanwezig zijn in de cellen van de menselijke luchtwegen en de darmen van vogels, maar ook door ook door furine-achtige proteasen. Ze handelen in combinatie
B OLOGIE EN MEDISCHE WETENSCHAP | Influenzavirussen: gebeurtenissen en voorspellingen |
met ubiquitine, dat is ontworpen om eiwitten te markeren die moeten worden vernietigd voor proteasen. Furine-achtige proteasen worden in verschillende weefsels gesynthetiseerd, waardoor pathogene virussen verschillende systemen en organen kunnen infecteren. Om een laag-pathogeen virus in een hoog-pathogeen virus te transformeren, is de invoeging van zelfs maar één basisch aminozuur in de proteolytische splitsingsplaats van hemagglutinine voldoende.
Dit werd vervolgens bevestigd in experimenten met muizen die waren geïnfecteerd met verschillende varianten (geïsoleerd in verschillende jaren) van het H5N1-virus. Sommigen van hen begonnen zich te vermenigvuldigen in de hersenen, lever, milt en bloedcellen, waardoor muizen op de zevende tot achtste dag na infectie voor 100% stierven, terwijl andere virussen niet-pathogeen bleken te zijn voor muizen en zich alleen in de loop van de tijd vermenigvuldigden. longen. Dit werd snel uitgelegd - in de H5N1-virussen die in 2004 werden geïsoleerd, werden, in vergelijking met de virussen verkregen in 1997-2003, aanvullende mutaties in het hemagglutinine-gen geïdentificeerd, die de verandering in hun antigene eigenschappen beïnvloedden.
De pathogeniteit van het virus kan worden beïnvloed door veranderingen in de structuur van niet alleen oppervlakte- maar ook interne eiwitten. Zo werd een mutatie ontdekt op positie 627 in het PB2-eiwit in de H5N1-influenzavirusstam, die zeer pathogeen is voor muizen. Het was deze mutatie die het verschil in de eigenschappen van de twee H5N1-virussen beïnvloedde die in Hong Kong werden geïsoleerd, en als gevolg daarvan het resultaat van het infectieuze proces. Bovendien wordt de virulentie van deze influenzavirussen geassocieerd met de structurele kenmerken van het niet-structurele eiwit NS, in het bijzonder met de aanwezigheid van glutaminezuur in zijn molecuul op positie 92, waardoor de virussen resistent zijn tegen de antivirale werking van interferonen. .
Natuurlijk verheldert het gebruik van moderne moleculair genetische methoden bij de studie van influenzavirussen geleidelijk hun biologische eigenschappen, maar traditionele methoden die de circulatie van influenzavirussen onder mensen, huisdieren en wilde dieren monitoren, zijn niet minder belangrijk. Het voorspellen van de opkomst van reassortanten met pandemische neigingen en het ontwikkelen van effectieve maatregelen voor de preventie en bestrijding van influenza kan alleen worden ontwikkeld op basis van het bestuderen van de ecologie en evolutie van de ziekteverwekkers van deze moeilijk te voorspellen en moeilijk te beheersen infectieziekte. Dergelijk onderzoek begon meer dan 35 jaar geleden door G. Laver in Australië, R. Webster in de VS, D.K. Lvov in ons land, en ze blijven tot op de dag van vandaag over de hele wereld bestaan.
Gebeurtenissen en voorspellingen
Een uitgebreid onderzoek naar influenza A-virussen werd door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) geïnitieerd na de pandemie van 1968, veroorzaakt door het H3N2-virus. Ons instituut heeft vastgesteld dat de voorloper van H3N2 een stam was die leek op het H3N8-virus dat in 1963 in Oekraïne uit wilde eenden werd geïsoleerd. Deze en andere gegevens dienden als basis voor de ontwikkeling van een wetenschappelijke richting: de ecologie en evolutie van influenza A-virussen. Het Nationaal Centrum voor de Ecologie van Influenza A-virussen werd opgericht met een netwerk van ondersteunende bases, waar nieuwe gegevens werden verkregen die nieuwe gegevens verzamelden. bevestigde de afwezigheid van fundamentele verschillen tussen influenza A-virussen bij mensen en dieren, d.w.z. de aanwezigheid van één enkele beschermde genenpool. Volgens deze gegevens werd in 1980 een classificatie van influenzavirussen opgesteld, ongeacht hun oorsprong. Sindsdien krijgt elk geïsoleerd virus een naam die het type virus, de bron van isolatie, de plaats en het jaar van isolatie weergeeft, evenals een subtype, bijvoorbeeld A/duck/Oekraïne/63(H3N8).
Het hoofddoel van ons onderzoek in Rusland was het bestuderen van de evolutie van influenza A-virussen in het proces van interactie van virale populaties met populaties wilde vogels en huisdieren en de vorming van stammen met epidemische potentie. Voor dit doel wordt monitoring uitgevoerd op belangrijke punten in Noord-Eurazië; 14 van de 16 bekende virussen werden geïsoleerd
Eind 2003, d.w.z. drie maanden vóór het uitbreken van de epidemie veroorzaakt door het H5N1-vogelgriepvirus in de landen van Zuidoost-Azië, sprak een van de auteurs van dit artikel (D.K. Lvov) op het internationale griepcongres in Japan, waarin hij verslag uitbracht over de isolatie van deze virussen
B OLOGIE EN MEDISCHE WETENSCHAP | Influenzavirussen: gebeurtenissen en voorspellingen |
van wilde vogels in Rusland - in Altai en in het zuiden van Primorye. Volgens moleculair genetische gegevens worden deze stammen geclassificeerd als laagpathogeen. Vervolgens werd, naar analogie met eerdere waarnemingen, de eerste voorspelling gedaan over de mogelijkheid van introductie ervan samen met trekvogels op pluimveebedrijven in Zuidoost-Azië, waar ze na verloop van tijd zeer pathogeen zouden kunnen worden met panzoötische en pandemische potentie. Blijkbaar is dit wat er is gebeurd. De uitbraak van de epizoötie verspreidde zich in korte tijd naar tien landen. De afgelopen tijd zijn ruim 150 miljoen kippen en eenden gestorven en geslacht. Volgens de WHO waren eind maart 2006 al 185 mensen besmet geraakt, van wie er 104 stierven. De epidemie duurt voort en de virussen zijn ook in de varkenspopulaties doorgedrongen, wat bijzonder alarmerend is. De wereld staat mogelijk aan de vooravond van een epidemiologische catastrofe: er kunnen zich op elk moment reassortanten vormen wanneer varkens tegelijkertijd besmet zijn met het H5-vogelvirus en de H1- of H3-menselijke influenzavirussen die over de hele wereld circuleren.
Er werd ook een tweede voorspelling gedaan: als wilde vogels in overwinteringsgebieden worden geïnfecteerd met hoogpathogene stammen, neemt het risico van hun introductie in Rusland toe, vooral in Siberië en het Verre Oosten, tijdens de voorjaarsmigraties. En toen gebeurde wat er moest gebeuren. Medio juli 2005 werd in bevolkte gebieden van de regio Novosibirsk, gelegen in de lacustriene noordelijke bossteppe van het Baraba-laagland, een epizoötie onder pluimvee ontdekt met een sterftecijfer van meer dan 90% en een snelle verspreiding.
Er werd materiaal verzameld van gedomesticeerde en wilde vogels die in de directe omgeving van de epizoötische locatie leefden. Met behulp van SPEV- en MDCK-cellijnen (deze onconventionele methode wordt momenteel gepatenteerd) isoleerden we zes H5N1-stammen uit pluimvee en fuut (Podiceps cris tatus), met zeer hoge weefselconcentraties van het virus. Met prioriteitsdatum 8 augustus 2005 werden deze stammen gedeponeerd in de State Collection of Viruses, en de sequentiegegevens van hun volledige genoom werden met prioriteitsdatum 5 september 2005 gedeponeerd in GenBank. De plaats van proteolytisch knippen van hemagglutinine van alle verkregen stammen bevat de aminozuursequentie PQGERRRKKRGLF, kenmerkend voor hoogpathogene vogelgriepvirussen. De nucleotidesequenties van de hemagglutininegenen van alle geanalyseerde pluimveevirussen bleken volledig identiek te zijn, maar verschilden van de stam geïsoleerd uit een wilde vogel (fuut), zij het slechts door twee nucleotidesubstituties (Fig. 3). Fylogenetische analyse onthulde een hoog niveau van homologie tussen de hemagglutininen van West-Siberische stammen en stammen die in de lente van hetzelfde jaar werden geïsoleerd uit de Indische gans (Anser indicus) aan het meer. Kukunar in de noordwestelijke provincie Qinghai (VRC). Dit werd volledig bevestigd bij het analyseren van de overige zeven genen.
De identiteit van de genetische kenmerken van de geïsoleerde stammen bewijst een direct verband tussen de virussen die circuleren in populaties van wilde en gedomesticeerde vogels. Tegelijkertijd verschillen de in 2005 ontdekte H5N1-griepvirusstammen aanzienlijk van de stammen van dit virus die in voorgaande jaren zijn geïsoleerd, waaronder de uit Engeland verkregen stam A/Vietnam/1194/2004(H5N1), die in ons land wordt aangeboden voor productie van vaccins. Het is duidelijk dat, althans voor een diergeneeskundig vaccin, alleen een stam uit de Staatscollectie van Virussen kan worden gebruikt die overeenkomt met de antigene eigenschappen van het virus dat in Rusland circuleert.
De stam die we hebben geïsoleerd en gedeponeerd in de staatscollectie van virussen, wordt al gebruikt voor de grootschalige productie van het vaccin op de federale staatsonderneming Stavropol Poultry Farm. In het Zuidelijk Federaal District wordt pluimvee gevaccineerd. Tegen 15 juni 2006 was het de bedoeling om 15 miljoen doses van het vaccin te produceren, met een verdere uitbreiding van de productie.
Overigens is het bij een pandemie, wanneer het nodig is om de productie van een vaccin snel op gang te brengen, naar onze mening raadzaam om als substraat cellijnen te gebruiken waarin het influenzavirus zich snel in hoge concentraties ophoopt. Deze nieuw ontwikkelde methode heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van de traditionele methode, waarbij gebruik wordt gemaakt van
B OLOGIE EN MEDISCHE WETENSCHAP | Influenzavirussen: gebeurtenissen en voorspellingen |
Er worden kippenembryo's gemaakt: terwijl alle antigene domeinen van hemagglutinine behouden blijven, elimineert het gekweekte vaccin het optreden van complicaties die verband houden met kippeneiwit. Dit is vooral belangrijk bij de productie van vaccins voor mensen. U hoeft alleen maar te weten welke soort moet worden gebruikt om mensen te immuniseren. Dit zal afhangen van het antigene profiel van de opkomende pandemische variant. Wellicht wordt het anders dan nu. Hoe dan ook is het gebruik van een levend vaccin absoluut onaanvaardbaar. Genetische interactie tussen vaccin- en veldvirussen kan leiden tot de opkomst van reassortanten met onvoorspelbare gevolgen.
Afb.3. De mate van verwantschap van de nucleotidesequenties van het hemagglutininegen van varianten van influenza A-virus subtype H5, geïsoleerd uit wilde en gedomesticeerde vogels in verschillende landen in de afgelopen 10 jaar. Hoogpathogene H5N1-stammen van de Qinghai-Novosibirsk-virusgroep zijn vetgedrukt weergegeven.
Analyse van het genoom van de stammen die we hebben geïsoleerd, bracht een aantal kenmerken aan het licht die verband houden met biologische eigenschappen. Naast de aminozuursequentie van de proteolytische splitsingsplaats van hemagglutinine, die het hoge niveau van pathogeniteit van het virus bepaalt, werden deleties gevonden op posities 49-68 in neuraminidase (genotype Z), wat duidt op een verhoogd tropisme van de virussen die we kennen. geïsoleerd voor pluimvee en potentiële pathogeniteit voor mensen. Glutaminezuur op positie 92 van het NS1-eiwit bepaalt de resistentie van het virus tegen interferon en verhoogde virulentie bij varkens. De lysine op positie 627 van het PB2-eiwit verklaart het vermogen van de bestudeerde stammen om zich in verschillende zoogdiercellijnen te reproduceren. De geïdentificeerde eigenschappen van het virus dat Rusland binnenkwam, duiden op de hoge pathogeniteit ervan voor pluimvee en mensen.
De aanwezigheid van serine, en niet van asparagine, op de 31e positie van M2 duidt op de gevoeligheid van het virus voor rimantadine, wat volledig samenviel met gegevens uit een directe studie naar het effect van antivirale middelen op de virusreproductie. Voor deze doeleinden gebruikten we ook cellijnen en ontdekten dat voor de preventie en vroege behandeling van griep zowel dure buitenlandse medicijnen - bijvoorbeeld Tamiflu, als relatief goedkope binnenlandse medicijnen, die verkrijgbaar zijn in apotheken - remantadine, even effectief zijn en kunnen worden gebruikt.
B OLOGIE EN MEDISCHE WETENSCHAP | Influenzavirussen: gebeurtenissen en voorspellingen |
virazol (voor intraveneus gebruik en aërosolgebruik), arbidol. Helaas is de productie van deze medicijnen momenteel afwezig of onvoldoende in het land, en het is dringend noodzakelijk om hun strategische reserves aan te leggen.
Hoe en wanneer is het hoogpathogene H5N1-griepvirus Rusland binnengekomen, en hoe zullen verdere gebeurtenissen zich ontwikkelen?
Afb.4. Verspreidingsroutes van het H5N1-griepvirus onder wilde en gedomesticeerde vogelpopulaties. Laagpathogene influenzavirussen (LPIV's) die in 1991 uit wilde en gedomesticeerde vogels in de noordoostelijke regio van het Altai-territorium en in 2001 in het zuiden van het Primorsky-territorium werden geïsoleerd, waren blijkbaar de voorlopers van de griepuitbraak in Hong Kong in 1997 en epizoötieën in Zuidoost-Azië in 2003-2005, evenals in Noordwest-China in 2005. Omdat ze zeer pathogeen waren geworden (HPPV), drongen deze virussen binnen tijdens de voorjaarstrek van wilde vogels naar West-Siberië, waar ze in de zomer een uitbraak van griep veroorzaakten van 2005 onder pluimvee. Tijdens de migratieperiode van water- en semi-watervogels verspreidde HPPV zich verder naar het noorden en westen van Eurazië, en in de winter van 2006 werden deze virussen al ontdekt in Afrika. Dikke pijlen duiden op een infectie met het influenzavirus uit het wild
vogels naar huisdieren en omgekeerd.
Ten eerste werden laagpathogene stammen die in Siberië en het Verre Oosten circuleren onder wilde vogels geïntroduceerd tijdens herfstmigraties naar de landen van Zuidoost-Azië (Fig. 4). Omdat ze daar zeer pathogeen waren geworden, kwamen ze, samen met wilde vogels, in het voorjaar van 2005 West-Siberië binnen en werden ze scherp actiever in de periode waarin de kuikens verschenen. Hoogpathogene stammen hebben zich met vogels verspreid naar broedplaatsen over een gebied van meer dan 10 miljoen.
km2. Nadat het virus de pluimveepopulatie binnendrong, vond er een uitbraak van epizoötieën plaats. Dit is ernstig en langdurig.
De derde voorspelling was dat wanneer de vogels in de herfst terugvliegen naar hun overwinteringsgebieden door dichtbevolkte gebieden van Rusland en andere landen, ze het virus opnieuw zullen verspreiden.
B OLOGIE EN MEDISCHE WETENSCHAP | Influenzavirussen: gebeurtenissen en voorspellingen |
En zo gebeurde het. In het najaar van 2005 had het virus de meeste Europese landen al bereikt; het werd ook aangetroffen in Turkije, de Krim, Iran, Azerbeidzjan, Georgië, India en ook in Afrika. En hier kwamen we in Tula, Kalmukkië en de Wolga-delta, waar in december 2005 een griepuitbraak plaatsvond onder de knobbelzwanenpopulatie (Cygnusolor) na een korte tussenstop van vliegende noordelijke eenden - kuifeenden (Aythya fuligula). De uit zwanen geïsoleerde stammen behoren volgens hun moleculair genetische analyse ook tot de Qinghai-West-Siberische groep virussen. Gedurende zes maanden van circulatie onder wilde vogels behielden de stammen hun genotype en verloren ze hun hoge pathogeniteit niet.
De vierde voorspelling is de meest alarmerende. Het virus heeft veel wateren in broedgebieden en vliegroutes besmet, en zal daar tot het voorjaar blijven. Elk natuurlijk waterlichaam dat uitwerpselen van geïnfecteerde vogels bevat, verandert in een ‘tijdbom’. Dit kan worden vergeleken met de betrokkenheid van veengebieden bij een taigabrand. In het voorjaar zullen geïnfecteerde en gezonde vogels terugkeren en door deze ‘mijnenvelden’ vliegen, waardoor de gebeurtenissen in de zomer van 2006 veel gevaarlijker kunnen zijn dan in het afgelopen seizoen. Dit wordt bevestigd door de lawineachtige verslechtering van de situatie in Europa, Azië en Afrika al in maart. Dit is al een panzoötie. En wanneer de hoogpathogene stammen die in de lente onder wilde vogels circuleren, terugkeren naar laagpathogene stammen, is het onmogelijk te voorspellen hoe lang het proces van hun herschikking zal duren - maanden of jaren. Het is duidelijk dat dit een onderwerp is van prioritair onderzoek, waarvan de ontwikkeling van de gebeurtenissen in de nabije toekomst afhangt.
Wat het pandemische virus betreft, kan het ook in ons land ontstaan nadat varkens zijn besmet met mens- en vogelvirussen. Maar het zal hoogstwaarschijnlijk vanuit China naar ons toekomen, waar de mogelijkheden voor transformatie van de reassortant bijzonder groot zijn, gezien de activiteit van het epizoötieproces en het enorme gevoelige contingent onder de bevolking. Een pandemisch virus kan op elk moment in ons land verschijnen - hiervoor is slechts één aminozuursubstitutie in de PCC van hemagglutinine voldoende, als resultaat zal het virus de receptoren van menselijke cellen beginnen te herkennen en dienovereenkomstig beginnen te worden overgedragen van persoon op persoon.
Wat vanuit ons standpunt nu op staatsniveau moet gebeuren, staat in de tabel geformuleerd. We gaan speciale aandacht besteden aan het bestuderen van de verdere evolutie van hoogpathogene stammen die de wilde vogelpopulaties hebben aangetast. Ecosystemen op Russisch grondgebied zijn daarbij van cruciaal belang. We zijn van plan de monitoring voort te zetten in het Europese deel van het land, in Siberië en het Verre Oosten, en mogelijk ook in enkele buurlanden.
De afgelopen vijf jaar is ons onderzoek uitgevoerd in samenwerking met jachtopzieners, ornithologen en medewerkers van de federale fytoveterinaire en sanitaire epidemiologische diensten van de regio’s Novosibirsk, Astrakan, Irkoetsk, het Primorskigebied, Birobidzjan, de republieken Kalmukkië en Boerjatië. Dit alles vond plaats in het kader van de federale programma’s “Bescherming tegen ziekteverwekkers”, “Ontwikkeling van middelen en methoden voor de bestrijding van bioterrorisme”, “Influenza A van varkens en vogels: interactie van populaties”.
Het zijn intracellulaire obligaatparasieten, wat betekent dat ze hun genen niet zonder hulp kunnen repliceren of doorgeven. Een enkel viraal deeltje (virion) is zelf inert. Wanneer een virus een cel infecteert, gebruikt het enzymen en het grootste deel van de celstructuur om zich te vermenigvuldigen.
In tegenstelling tot wat we zien bij celdelingsprocessen zoals en, produceert virusreplicatie veel nakomelingen die de gastheercel vernietigen en vervolgens andere cellen in het lichaam infecteren.
Viraal genetisch materiaal
Virussen kunnen enkelstrengs/dubbelstrengs DNA of RNA bevatten. Het type genetisch materiaal dat in een bepaald virus wordt aangetroffen, hangt af van de aard en functie ervan. De exacte aard van wat er gebeurt nadat een gastheer is geïnfecteerd, varieert afhankelijk van de aard van het virus.
Het replicatieproces zal verschillend zijn voor dsDNA-, ssDNA-, dsRNA- en ssRNA-virussen. Dubbelstrengige DNA-virussen moeten bijvoorbeeld doorgaans gastheercellen binnendringen voordat ze kunnen repliceren. Enkelstrengige RNA-virussen repliceren echter voornamelijk in gastheercellen.
Zodra een virus een gastheer infecteert, worden componenten van het virale nageslacht geproduceerd door cellulaire machines, en de assemblage van de virale capside is een niet-enzymatisch proces. Virussen kunnen doorgaans slechts een beperkt aantal gastheren infecteren. Het ‘slot en sleutel’-mechanisme is de meest voorkomende verklaring voor dit fenomeen. Bepaalde eiwitten op het virusdeeltje moeten overeenkomen met bepaalde receptoreiwitten op het celoppervlak van een bepaalde gastheer.
Hoe infecteren virussen cellen?
Het basisproces van infectie en replicatie van het virus vindt plaats in 6 fasen:
- Adsorptie - het virus bindt zich aan de gastheercel.
- Binnenkomst - het virus introduceert zijn genoom in de gastheercel.
- Virale genoomreplicatie - Het virale genoom wordt gerepliceerd met behulp van de cellulaire structuur van de gastheer.
- Assemblage - virale componenten en enzymen worden gevormd en beginnen zich te assembleren.
- Rijping - virussen ontwikkelen zich uit de geassembleerde componenten.
- Exit - nieuwe virussen breken uit de gastheercel op zoek naar nieuwe slachtoffers om te infecteren.
Virussen kunnen elk type cel infecteren, inclusief
De familie van orthomyxovirussen (Grieks orthos - correct, tukha - slijm) omvat influenzavirussen van de typen A, B, C, die, net als paramyxovirussen, affiniteit hebben voor mucine. Influenza A-virussen infecteren mensen en sommige diersoorten (paarden, varkens, enz.) en vogels. Influenzavirussen type B en C zijn alleen pathogeen voor de mens. Het eerste menselijke influenzavirus werd in 1933 bij mensen geïsoleerd door W. Smith, C. Andrews en P. Ladow (WS-stam) door witte fretten te infecteren. Later werd dit virus geclassificeerd als type A. In 1940 ontdekten T. Francis en T. Megill het influenzavirus type B, en in 1949 ontdekte R. Taylor het influenzavirus type C. Bij het classificeren van influenzavirussen zijn er altijd bepaalde problemen geweest. zijn aangetroffen, geassocieerd met hun antigene variabiliteit. Influenzavirussen zijn onderverdeeld in drie typen A, B en C. Type A omvat verschillende subtypen die van elkaar verschillen in hun antigenen: hemagglutinine en neuraminidase. Volgens de WHO-classificatie (1980) zijn menselijke en dierlijke influenzavirussen type A onderverdeeld in 13 antigene subtypen op basis van hemagglutinine (H1-H13) en 10 op basis van neuraminidase (N1-N10). Hiervan omvatten menselijke influenzavirussen type A drie hemagglutininen (HI, H2 en NZ) en twee neuraminidasen (N1 en N2). Voor het type A-virus wordt het subtype hemagglutinine en neuraminidase tussen haakjes aangegeven. Bijvoorbeeld influenza A-virus: Khabarovsk/90/77 (H1N1).
